3种检测吡咯喹啉醌的方法比较

［摘要 ］研究和比较3种检测吡咯喹啉醌（PQQ）的方法，确定各种方法的特点和适用范围。

［关键词］吡咯喹啉醌 ；检测方法；电泳法（Native－PAGE 法）；光谱法；NBT－Gly 法。

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是20世纪70年代末发现的一种不同于吡啶核苷酸（NAD、NADP）和核黄素（FMN、FAD）的第三类辅酶。PQQ适合生物发酵法生产。为了简单快速的检测发酵液中的PQQ，我们设计并改进了3种检测方法：Native－PAGE 法（Native－PAGE 法）、光谱法、和NBT-Gly法。

本文利用山梨脱氢酶与其专一性辅酶PQQ结合催化底物山梨糖的特性，设计了利用氯化硝基四氮唑蓝染色体检测Native－PAGE 法中PQQ的方法。

光谱法是以D_326nm值与D_400nm值来检测PQQ的含量。

NBT-Gly法利用了PQQ的氧化还原特性，参照文献加以改进，引入96孔板和酶标仪，缩小了反应体系，增加了一次检测的样品数量。

1 材料与方法

1.1 材料（具体见文献）

1.2 样品制备（具体见文献）

1.3 分别用活性电泳检测法、光谱法、NBT-Gly法进行检测。

2 结果

2.1 检测限和线性范围

利用PQQ标准品确定了3种方法的PQQ检测限，活性电泳检测可检测出12.6ng/ml以上的PQQ含量；光谱法检测，当△D_326nm-400nm为0-0.7时，PQQ浓度与吸光度之间的线性关系良好，线性范围为2.46-26.27μg /ml。NBT-Gly法的线性范围为44.250ng/ml-1.416μg /ml，由于还原型NBT的不溶解性，高浓度时呈絮状，导致吸光度值下降。

2.2 精密度实验

考察了光谱法和NBT-Gly法的组内精密度和组间精密度。在各方法的线性范围内选择5个PQQ浓度，n=3。其具体数值见表1

2.3 样品检测和加样回收率

采用Native－PAGE 法检测供试样品时，在同一块聚丙烯凝胶上与不同浓度的标准品相比，3个样品的PQQ含量大量为6.25-12.5μg /ml.用NBT-Gly法和光谱法检测样品PQQ含量时，在相同条件下制作标准曲线，通过回归方程计算得到样品的PQQ含量（表2、3）。在供试品中加入标准品，考察加样回收率（n=3）（表2、3）。进行样品检测时，光谱法必须扣除培养基背景干扰，而其它两法可忽略。

3  讨论

Native－PAGE 法 PQQ 检测下限为 12.6 ng / m L，灵敏度高，而且利用了 SDH 与辅酶和底物相互作用的特异性，抗干扰性强，适于培养上清等复杂样品的粗略定量。 但该法不能用于 PQQ 的准确定量，因而未考察其精密度和加样回收率。

光谱法在 PQQ 浓度为 26.27 μg /m L～2.46 μg /m L 时与吸光度值呈现很好的线性关系，精密度好。进行发酵样品上清中 PQQ 含量检测时，可将样品进行适当稀释，使 PQQ 含量落在光谱法的线性范围内。

NBT－Gly 法线性关系较好，在 1.416 μg / m L～44.250 ng / m L 时呈线性关系 ， 但重复性不佳 ，RSD偏高，加样回收率为 99．64％～119．68％。 NBT－Gly 法的优点是操作简便，一次可检测多个样品。

由于Native－PAGE 法检测的灵敏度很高，在筛选 PQQ 产生菌时，可先进行Native－PAGE 法检测，确定是否含有PQQ，后用光谱法和 NBT－Gly 法进行定量。 NBT－Gly 法操作简便，检测量大，有利于从大量样品中筛选高产菌株。光谱法精密度高，但在检测样品时会受到培养基的干扰，将 PQQ 纯化后用此方法检测可得到精确的 PQQ 浓度。

本文为PQQ检测提供了3种简便易行的方法，不需要昂贵的仪器，操作过程简单，可根据实际需要选用。

文献

[1] 杨延新，熊向华，游松，张惟材.3种检测吡咯喹啉醌的方法比较[J].生物技术通讯2011，22（22）：544-547