银耳多糖的提取分离与纯化

摘要：研究银耳多糖的提取分离与纯化

关键词：银耳多糖；纯化

银耳多糖是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖，从椴木银耳中提取分离得到的酸性银耳多糖具有广泛的药理活性,具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、等作用^[1]，能增强机体耐缺氧能力，清除自由基，能使人体产生抗体及干扰素。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料 椴木银耳

1.2 试剂

2%的氢氧化钠:10g氢氧化钠加少量水溶解,定容至500mL,转入试剂瓶保存备用;1%活性碳;称取重蒸苯酚50g,定容至1000mg·mL- 1,配成5%的苯酚溶液,避光低温保存待用;标准葡萄糖溶液(0.1mg·mL- 1):100mg标准葡萄糖定容至1000mL;硫酸,乙醇,丙酮,乙醚:均为AR级;DEAE-C52;Sevage试剂:氯仿-正丁醇溶液;0.5mol·L- 1盐酸:41.5mL盐酸加水稀释到1000mL,试剂瓶保存备用;2mol·L- 1 NaCl溶液500mL。

1.3 仪器

双重蒸馏水蒸馏器，超级恒温水浴，旋转蒸发仪RE52型，紫外可见分光光度计752N，低速大容量多管离心机LXJ-ⅡB型，透析袋，铝锅，搅拌器，天平，精密电子天平,电炉等。

2 实验方法

2.1 银耳多糖的提取

将20g银耳子实体和800mL水加入1000mL烧杯中，于沸水浴中加热搅拌8h，离心去残渣(3000r/min,25min)。上清液用硅藻土助滤，水洗，合并滤液后于80℃水浴搅拌浓缩至糖浆状。用2mol·L-1NaOH调至pH 7，加热回流，用1%活性炭脱色,抽滤,滤液扎袋,流水透析48h。透析液离心(3000r·min-1,10min),上清液于80℃水浴浓缩至原体积的1/3。然后加入3倍量95%乙醇,搅拌均匀后,离心(3000r·min-1,15min),沉淀用无水乙醇洗涤2次,乙醚洗涤一次,真空干燥得银耳多糖粗品。提取银耳多糖的工艺流程(见图1)。

2.2 银耳粗多糖的纯化

2.2.1 多糖液脱蛋白：

将粗多糖样品溶于一定量的蒸馏水中，加入2/3体积的Sevage试剂(氯仿∶正丁醇= 5∶1，v/v)，然后将其置于分液漏斗中充分振摇10min，静置分层。分液除去蛋白质沉淀后继续加入Sevage试剂，重复3次。粗糖液蒸发浓缩，真空干燥得以进一步提纯的粗多糖样品，供季铵盐法(CTAB)沉淀用。

2.2.2 季胺盐沉淀法提纯粗多糖：

0.5g银耳粗多糖溶于50mL水中，溶解后离心(3000r·min- 1，10min)去除相应的沉淀,上清液加2%CTAB溶液至沉淀完全，摇匀，静置4h,离心，沉淀用热水洗涤3次，加100mL 2mol·L- 1 NaCl溶液于60℃解离4h,离心(3000r·min-1，10min),上清液流水透析12h。透析液于80℃水浴浓缩，加三倍量95%乙醇，搅拌均匀后，离心(3000r·min-1,10min)，沉淀再分别用无水乙醇、乙醚洗涤，真空干燥，得精品银耳多糖，测定多糖含量。

2.3 多糖含量测定

硫酸苯酚比色法测定糖含量：其原理是，糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10mg～ 100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。此比色法方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上。

2.3.1 制备标准曲线：取5支洁净的糖管，按表1操作。

表1： 糖含量测定操作表

2.3.2 样品糖含量测定：配制0.1mol·L的样品液（粗品和精品），分别取1ml于试管中，其他操作同上。

3 实验结果

3.1 银耳多糖的产量与产率（见表2）

表2 银耳多糖纯化前后产量与产率

3.2 多糖含量测定的标准曲线（见图2、表3）

图二：标准曲线

表3：多糖含量测定实验数据

3.3 样品糖含量测定：样品中粗品A=0.478，精品A=0.614.由回归线方程A=1.1145C+0.0298得到粗品含糖0.495/0.1=50.5%；精品含量76.28%。

4 讨论

本实验采用的是季铵盐（CTAB）沉淀法提取粗多糖，其原理为：

长链季胺盐能与酸性多糖成盐形成水不溶性化合物,可分离酸性及中性多糖。常用的季胺盐是十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性,但其在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,却不能沉淀核酸,所以我们在提取银耳多糖后先用Sevage试剂[2]去除溶液中蛋白质,再通过加入CTAB沉淀银耳多糖，最后加入乙醇沉淀即可使多糖分离出来。一般地说,酸性强或分子量大的酸性多糖首先沉淀出来。

季铵盐沉淀法纯化效果较好，既经济又具有实用性，很适宜工业生产。在提取过程中可适当加热，温度不宜高过60℃，且需要不断的搅拌以使提取能够充分。经检测，粗品经过CTAB法纯化产率在37.4%，粗品中含糖50.5%。纯化之后继续检测得到的产品，结果显示产品含糖最高达76.28%。

文献

[1] 聂伟,张永祥,周金黄.银耳多糖的药理学研究概况[J]，中药药理与临床.2000,16(4):44- 46.

[2] evag MG:Biochen Z:273:419.1994.

[3] 和伟珍,吴丽仙.银耳多糖的提取分离与纯化[J]，海峡药学.2008,20(7):33-35.