液质联用法测定蔬菜和水果中的烟酰胺单核苷酸

B-烟酰胺单核苷酸（NMN）是人体内一种内源性物质，由于烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成，随后NMN又在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。近期在研究NMN的相关作用在医药保健品方面的开发应用。质谱定量具有灵敏度高、选择性好等特点，可以有效降低基质干扰带来的测定误差。鉴于NMN诸多的保健治疗作用，测定蔬菜、水果中NMN的含量具有重要的实用价值和意义。

1 仪器、试剂与材料

仪器：4000Qtrap串联三重四级杆线性离子阱质谱仪、LC-20AD高效液相色谱仪、Milli-pore超纯水仪、超声波、万分之一天平、蠕动泵

试剂：甲醇、超纯水、nmn标准品、乙酸、1ml医用注射器、0.22um微孔滤头

材料：牛油果、西兰花、卷心菜

2 实验方法

2.1 样品制备

将牛油果、西兰花、卷心菜切成小块，精确称取3.5g左右（分别取2个做平行样），加入5ml、50%的甲醇水溶液，超声萃取30min，用1ml医用注射器取上清，经0.22um过滤头过滤后立即上机测试。

2.2 仪器条件

色谱条件：岛津ngShim-pack VP-ODS（150Lx2.0,50um)色谱柱，样品室为室温。流动相：A为0.1%的乙酸水溶液，B为含2mmol/L醋酸铵的甲醇溶液，流速为0.3ml/min，柱温40℃，进样量为10ul.梯度洗脱条件见下表：

质谱条件：采用电喷雾离子源，在正离子电离模式下选用多反应离子监测扫描模式进行定量分析；点喷雾电压5500V，离子源温度为500℃，离子源辅助气GSI/GS2气流均为50L/h。

3 结果与分析

3.1 进行质谱参数优化

3.2 进行色谱条件优化

3.3 样品前处理方法的优化

精确称取3.5g卷心菜10份，分别加入5ml超纯水、20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇水溶液（2个重复），分别在15、30、45、60、75min取50uL上清液进行分析（进针2次）。结果表面：每种试剂都是在0~30min区间NMN含量逐渐升高，45min后有不同程度的下降，60min后含量基本保持稳定；其中在0%~50%甲醇含量区间，随甲醇含量升高同一时间NMN萃取效率逐渐升高；甲醇含量超过50%以后，萃取效率没有明显升高；30min以后NMN含量因降解开始下降，萃取试剂含水量越高，NMN降解速度越快，甲醇含量越高降解曲线越平稳；但是甲醇含量越高，基质干扰越严重，因此综合考虑选用50%甲醇水溶液超声萃取30min的前处理方法。

3.4 方法学考察

3.4.1 标准曲线绘制及方法的检出限、定量限

标准溶液配制后，绘制标准曲线，得到线性方程y=21200x-23800(R=0.998)，在0.143~228ug/L浓度范围内线性关系良好。

3.4.2 精密度实验

28.5ug/LNMN标准溶液重复进样5次，结果平均值为28.24ug/L，相对标准偏差为2.2%。

3.4.3 回收率

利用空白添加计算回收率。经计算NMN的回收率为86.6%~108%，相对标准偏差为3.4%。

3.5 实际样品检测

分别称取牛油果、卷心菜和西兰花鲜样3.5g（2个重复），经2.1节方法处理后，在2.2节仪器条件下上机测试，由标准曲线定量得到每100g牛油果、卷心菜和西兰花鲜样中NMN的含量分别为6.519ug、4.091ug、2.30ug。

4 结论

文中介绍的蔬菜、水果中NMN的测定方法，具有快速、灵敏、选择性高等特点；前处理简单，不需要提纯、浓缩等步骤，不仅可以为蔬菜、水果的营养价值分析及药用价值开发研究提供技术支持，还可以为人们日常膳食营养搭配和病人食疗保健提供理论指导。

文献

[1] 李东芹.液质联用法测定蔬菜和水果中的烟酰胺单核苷酸[J].实验技术与管理，2019,36[9]:57-59.